Undersökande av bakteriella toxiner substratspecificitet via reaktivt protein – proteom profilering, RP3

Projektbeskrivning

Sjukdomsframkallande bakterier har under evolutionens gång utvecklat många sätt att påverka våra celler. Vissa bakterier förökar sig inuti cellerna, medan andra ser våra celler som föda och tar kål på dem för att tillskansa sig näring. Gemensamma nämnaren för de sjukdomsframkallande bakterierna i stort är att de använder olika typer av toxiner för att uppnå sina syften. Dessa toxiner som injiceras i värdcellen av bakterien slår generellt mot de centrala komponenterna av värdcellens signalsystem och cellskelett. Toxinerna har nästan alltid en specifik enzymatisk aktivitet och använder reaktiva metaboliter för att kemiskt modifiera proteiner i värdcellen. I dag förstår vi inte systemen i detalj – vi vet inte mycket om den egentliga substratprofilen hos toxinerna Det saknas generiska metoder för att isolera alla modifierade proteiner relaterade till ett toxin ur till exempel cellysat, då antikroppar inte tillåter effektiv anrikning för proteomik. Vår slutsats är att det behövs nya kemiska metoder för att komma runt de begränsningar som för närvarande föreligger vad det gäller att isolera och identifiera bakteriella toxiners egentliga substrat.

Konceptet ”Activity-Based Proteome Profiling” (ABPP) adresserar enzymatiska aktiviteter med små molekyler, där en elektrofil funktionell grupp reagerar med de katalytiska aminosyrorna i enzymen. Molekylen har en affinitetstagg, med vilken man fiskar ut de enzymer som har bundit, varefter de identifieras via proteomik. Ifall molekylen är cellpermeabel så funkar konceptet i cellkultur, även i levande organismer. ABPP har fått ett enormt genomslag. Vi avser att flytta ABPP-konceptet från reaktiva småmolekyler till reaktiva makromolekyler – enzymer i form av bakteriella toxiner. Akronymen ”RP3 ” Reactive Protein-Proteome Profiling beskriver den bärande idén. Vi avser att konvertera bakteriella toxiner till kovalenta affinitetsreagens – för att sedan utvärdera deras substratprofil. Bakteriella toxiner med transferasaktivitet använder nukleotider som co-substrat. Vi introducerar en måttligt reaktiv elektrofil i nukleotiden och reducerar storleken på densamma – för att passa i toxinet – parallellt som vi introducerar en cystein i bindningsfickan för att binda nukleotiden kovalent i toxinet. I cellysat kommer det binära toxin-nukleotidkomplexet träffa på sina substrat och reagera, men produkten kan inte lämna toxinet, eftersom co-substratet är bundet i toxinet. Då toxinet har en affinitetstagg kan det tertiära komplexet anrikas och isoleras, för att identifieras genom proteomik. Vi har data som visar att konceptet fungerar för toxinet IbpA med dess substrat cdc42 och en reaktiv ATP-analog.

Projektet innehåller fyra delmål med syftet att skapa en kemisk verktygslåda för att kunna adressera biologiska frågeställningar runt toxin-medierade modifieringar av värdcellproteiner vid bakteriell infektion. I delmål 1, som också är starten på projektet kommer vi att utveckla kemin för en panel av elektrofila nukleotider (trifosfater, och NAD+) speciellt för att adressera Fic-domän-innehållande nukletidoyltransferaser och ADP-ribosytransferaser. Under delmål 2 kommer vi rekombinant framställa cysteinmutanter av ett antal toxiner tillhörande de två grupperna ovan och undersöka reaktionen med respektive nukleotider. Ett antal (runt 5) mutanter av vardera toxin kommer att produceras. Vi avser att utvärdera minst fem toxiner ur vardera klasser ovan. En nukleotidbindningsassay baserad på intakt proteinmassa kommer facilera att selektera mutanter. Under delmål 3 kommer vi att optimera förhållanden för att kovalent inbinda toxiner med reaktiva nukleotider och applicera dessa i cellysat, inklusive det efterföljande arbetsflödet i avseende på proteomik. Slutligen, som delmål 4, med nukleotiderna från delmål 1 i hand, cysteinmutanterna från delmål 2 tillgängliga och det optimerade arbetsflödet från delmål 3 kommer vi att utvärdera de egentliga substratprofilerna för en panel av toxiner tillhörande de ovan nämnda klasserna med proteomik. Tanken är att detta skall ge avgörande information för att förstå toxinernas funktion för bakteriell virulens och patogenicitet i ett större sammanhang. Avsikten är att vidare utveckla den kemiska metodiken och öka projektets kontaktyta mot biokemi och infektionsbiologi.